位于纽约的自然历史博物馆展列着史前生物、古代战士、被时间的流沙埋掉的原始部落、非洲的草原动物以及改变了历史的传奇英雄等展品，它们都被支撑了栩栩如生塑像和标本。对于博物馆的新守夜人赖瑞·戴利（本·斯蒂勒 饰）来说，这是一个能够争取到儿子尼克（杰克·切瑞 饰）的抚养权的谋生手段。赖瑞·戴利认为自己生来就是“做大事”的人，然而大半辈子的“怀才不遇”，让他连填饱肚子都成问题。他的前妻即将再婚，为了不让她带走自己最爱的儿子，赖瑞·戴利决定向生活低头，接受了这份不需要什么创造力的工作。

工作的第一个晚上，赖瑞·戴利拿着一个超大的手电筒，百无聊赖地漫步在走廊，他觉得这个夜晚对于自己来说，将会既平静又孤独，直到一批预想不到的“访客”突然造访。赖瑞·戴利一直想象着有一天自己会成为大人物，但从没想过是以这种方式：他惊奇地发现，当太阳最后的光芒消失在地平线上后，博物馆的一切都活了过来，就如同被施了魔法般活灵活现地围绕在他身旁，开始了一系列的破坏活动，霸王龙和匈奴王破坏了大理石走廊，而雄狮和猴子则在陈列柜中漫步。赖瑞·戴利傻了，不知道如何才能让博物馆恢复常态。

这时，美国第26届总统罗斯福的雕像（罗宾·威廉姆斯 饰）突然发声，吓了神情紧张的赖瑞·戴利一大跳，不过有了这位伟人的帮忙，赖瑞·戴利很可能不会丢掉他刚刚到手的工作，而且还会实现梦寐以求的历险梦想：他一直等待的伟大时刻，终于到来了